前列腺癌文献：CRISPR 筛选适度发现前列腺癌的新靶点

个持续性状，每个持续性状有 4-10 个单一路上 RNA (sgRNA)。比方说，用做触发检验的 CRISPRa 和 SAM 月刊以及用做诱导检验的 CRISPRi 月刊也是对等的[ 25、26、27 ]。可唯库里对于着迷的特定学术研究很精确 [ 28 ]。

.2. 月刊和转导的流感病毒纸制

可用 CRISPR/Cas9 系统开展混合检验的第一步是聚合一个颇受 sgRNA 月刊快流感病毒细菌感染的颇受冲击肝细胞月刊。通过将 sgRNA 月刊转染到适当的寄动物肝细胞中都来造成了流感病毒，同上如兼具不俗流感病毒年产的 HEK 293FT 肝细胞。为可避免在寄动物肝细胞闲置多个 sgRNA 并针对每个肝细胞小分子多个持续性状的情况下造成了误用，通过经验考虑到流感病毒滴度来前提较低 (~0.3) 细菌感染同义 ( MOI ) [ 27、29、30 ]。举足轻重的是要注意这一步的显然——一些基本概念，如 PCa 的 NCI-H660 和 VCAP 肝细胞，使得通过快流感病毒作法制定基本功能变得非常兼具说服力。

2.3. 基于生存能力的检验

最基本的实验之一是比对颇受到影响肝细胞生存能力的持续性状。由于降较低肝细胞适应度的扰动将在检验结束时耗尽或完仅有不长期存在，因此这种同型式的检验被称为负唯项检验。负唯项检验最常用做帕金森氏症动物学科技领域，以比对由于特定持续性状、拷贝数转变、传达模式和其他要能激起的骨髓肝细胞的发挥作用 [ 24 , 31 , 32 , 33 , 34 ]。最简单的负唯项检验基本上之一是较长时间整年培育出肝细胞，以比对肝细胞多见于所需的持续性状。这种检验已被用做比对测试肝细胞系所需的前提持续性状和特定癌肝细胞系中都持续性状发挥作用的一小第一组持续性状 [ 35 , 36 , 37 ]。另一种负唯项检验基本上，在兼具给定遗传学背景的肝细胞系中都开展，是比对化学合成窒息相互间起着的典范，其中都两个持续性状的同时诱导不会侵害肝细胞创造力 [ 38 ]。化学合成相互间起着的见到将使癌肝细胞的小分子治疗法成为确实，使口服仅对兼具特定转变的肝细胞起起着，并可以为帕金森氏症治疗法共享一种新作法。 特征持续性唯项检验的替代方案是阳持续性唯项检验，它侧重于在一段时间内富含的肝细胞。这些检验已用做比对对糖类 [ 14、17、39 ] 、 条件[ 40 ] 和 致病细菌感染， 造成了 发挥作用的 扰动 ]。在正唯项检验中都，大部份持续性状被无缘，少数幸存的扰动确实不会富含将近 100 倍。

再次，单个检验可以加剧阳持续性和特征持续性唯项的基因同型。同上如，癌肝细胞系的基于创造力的 KO 检验可以概要癌持续性状的可用和骨髓诱导系数的富含。不一定，中都等剂量的糖类可以比对致敏持续性状和发挥作用持续性状[ 46 ]。

2.4. 标识唯项画面

标识唯项检验旨在比对颇受到影响特定研究报告分子会传达的遗传学电子元件，基因同型不是基于肝细胞创造力，而是基于颇受到影响标识复合物传达的持续性状。在这种同型式的检验中都，可以通过用荧光标识附加着迷持续性状的字符碱基来对研究报告持续性状开展持续性状工程。再次，荧光触发肝细胞分唯 (FACS) 允许通过对兼具颇受到影响标识传达的 sgRNA 小分子持续性状的肝细胞开展分唯来比对上游传达恒定系数 [ 27 , 47 ]。

2.5. 比对（算法）

在唯项解决办法之前，从存活的肝细胞或 FACS 唯项的肝细胞中都收集 DNA，并可用 PCR 从肝细胞群中都分离持续性状第一组 DNA 并读取督导基因同型的持续性状。随后，可用早先DNA (NGS) 开展大体量并行DNA，以覆盖字符 sgRNA 的区外域。原先的几种算法，同上如基于基本概念的仅有持续性状第一组 CRISPR/Cas9 KO 比对 (MAGeCK) [ 48 , 49 , 50 ], edgeR [ 51 ], 持续性状直觉的贝叶斯比对 (BAGEL) [ 52 ], CRISPR AnalyzeR for Pooled Screens (caRpools) [ 53 ]，可用 Python (PinAPL-Py) [ 54 ] 和 DrugZ [ [ 55 ] 然后可用做通过核查印证和基因同型材料相互间 sgRNA 金属量的差异来考虑到督导仔细观察到的基因同型的候唯持续性状。

2.6. 解析

检验比对共享了加剧基因同型的候唯持续性状的查找列表。为了审计哪些持续性状对基因同型有作出贡献以及有多少，解析是必不可少的。最关键持续性的解析作法是通过引入小分子着迷持续性状的 sgRNA 来审计所唯基因同型是否确实可抹去。未来会对 sgRNA 特异持续性的改进减轻了推定与遗传物质紧密结合的无需，只要针对同一遗传学电子元件的多个 sgRNA 引致基因同型。

但是，如果无需，可以开展持续性状第一组 PCR、RT-qPCR 和复合物质印迹等比对来审计要能持续性状的系统修饰 [ 25 , 27 ]。举足轻重的是要注意，对要能举办活动的推定并不排除由于扯靶效应而造成了基因同型的确实持续性。因此，不仅可用兼具最很高小分子活持续性的一个 sgRNA 还可用每个持续性状的多个 sgRNA 对基因同型开展整年解析实验是至关举足轻重的。拯救实验是另一种推定遗传学实体是否给与基因同型的作法。要能是推定在 CRISPR/Cas9 总编辑的肝细胞中都将候唯传达完仅有恢复到生理水平是否不会使肝细胞完仅有恢复到它们的野生同型长时间 。

3. PCa 中都的 CRISPR 检验

迄今，已在 PCa 中都研究报告了几种 CRISPR 检验。本节将参阅每种画面同型式的归入结果（ 表格1 ）。

3.1 见到潜在要能

第一个 CRISPR-KO 检验于 2014 年初整年发表 [ 17 ]。然后，Fei 等人。刊文了 2017 年关于 PCa 肝细胞中都仅有持续性状第一组 CRISPR-KO 检验的第一篇论文 [ 57 ]。他们在 LNCaP 肝细胞中都可用 GeCKO v2 月刊开展了基于创造力的检验，并可用他们定制开发的 MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 算法将 HNRLP 比对为 PCa 多见于所需的前提持续性状 [ 48 , 49 ]。HNRNPL 通过线持续性唯项持续性剪接或反向剪接 circRNA 形成如此一来恒定其 RNA 遗传物质，最主要 AR 字符遗传物质。举足轻重的是，HNRNPL 及其 RNA 遗传物质都在 PCa 中都异常传达，支持它们的临床学术研究相关持续性。他们得出，HNRLP 是 PCa 的潜在治疗法靶点。比方说，可用核复合物 sgRNA 子库里库里的 CRISPR-KO 检验概要了 17p 的杂合弱点，这在高血压 PCa 字段中都经常检查到（很高达 63%），它给与了对 RBX1 的唯项持续性贫乏 [ 58 ]。RNAP2和RBX1的同时诱导以来进行方式诱导CRPC的多见于，这强既有了RNAP2胺α-鹅膏菌素多肽的抗EpCAM抗体的治疗法真实感。Aquirre 等人。在最主要 PCa 在内的 33 种癌肝细胞系中都开展了持续性状第一组体量的系统夺去遗传学乙同型肝炎 [ 59 ]。吉山等人。随后比对他们在 PCa 肝细胞系中都的画面图表，这些图表是从 CRISPR-KO 画面 [ 60 ]、帕金森氏症贫乏图 (DepMaP) [ 61 ] 的公共资源给予的 ]。他们将第一组复合物去甲基既有复合物 JMJD1C (KDM3C) 考虑到为 AR 特征持续性的特定于词法的漏洞。在几个 PCa 基本概念中都，他们解析 JMJD1C 可用通过触发骨髓坏死系数 α (TNFα) 网络加剧 AR 特征持续性肝细胞的特异持续性多见于诱导。就此，他们得出，将 JMJD1C 诱导比对为 AR 特征持续性 PCa 的特定脆弱持续性，确实为接颇受 AR 胺治疗法的 PCa 高血压共享替代口服靶点。

克尔等人。在高血压 PCa 基本概念中都开展了第一次持续性状第一组体量的 CRISPRi 检验，以考虑到肝细胞存活所需的持续性状 [ 62 ]。他们解析，涡轮复合物家族成员 4A (KIF4A) 和 WD 以此类推域 62 (WDR62) 在肾脏和细胞内有助于侵袭持续性 PCa 基因同型，从而将 KIF4A 和 WDR62 背书为 PCa 涡轮持续性状，并紧密结合其临床学术研究图表。 标识唯项检验，一种基于 CRISPR 的 E3 连接复合物检验作法在 DsRed/EGFP-PDK1 研究报告持续性状 HKT 肝细胞中都由 Jian 等人开展。见到 Cullin3SPOP E3 连接复合物有助于 PDK1 泛素既有和随后的交联 [ 63 ]。除此以外的是，有约 15% 的 SPOP 持续性状已在 PCa环境中都见到[ 64、65、66 ]。他们可用 PCa 肝细胞系开展了学术研究，其中都 SPOP 以 CK1/GSK3β 细胞内的磷酸既有和 degron 发挥作用方式比对 PDK1。无论是 SPOP 的系统弱点持续性状还是其紧密结合区外 PDK1 的系统给予持续性状都增强了 SPOP 对 PDK1 的比对和泛素既有，加剧 PDK1 复合物金属量、AKT 激复合物活持续性升很高和骨髓病变的其所，暗示PDK1-AKT 自营将成为持续性状的 SPOP 或 PDK1 涡轮的 PCa 的潜在遗传物质。

3.2. 见到口服诱导的化学合成攻击力靶点和致病机制

ADT 用做治疗法局部晚期和高血压 PCa，在大多数高血压中都付诸纾缓。 尽管 ADT 在大多数高血压中都共享了持续 1-2 年的几乎考虑到的纾缓，但随着 CRPC [ 5 ]的出现，癌肝细胞变得致病。AR 接收机诱导在 CRPC 中都起着关键持续性起着，正如阿比特龙和恩杂鲁胺等 AR 诱导口服的持续持续性所解析的那样。幸好的是，高血压对这些口服造成了特异持续性并总是死于这种病症 [ 74 , 75 , 76 ]。 通过仅有持续性状第一组 CRISPR/Cas9 检验，Palit 等人。比对了崩解 3 (TLE3) 的转导素样强既有剂作为 AR 胺适合于持续性的恒定剂，一旦丢弃，就不会给与 PCa LNCaP 肝细胞对恩杂鲁胺的发挥作用 [ 67 ]。有趣的是，与 TLE3 和 AR 在 GR 持续性状座的紧密结合一致，TLE3 弱点加剧止痛药复合物 (GR) 传达降至。他们的结果为在 PCa 肝细胞中都 AR 诱导背景下 GR 持续性状座的恒定共享了重新立论，暗示 TLE3 是 GR 细胞内的 AR 胺发挥作用的恒定剂。可用相似的作法，该小第一组随后着手比对其诱导起着可以强既有恩杂鲁胺在 PCa 肝细胞中都的功用的激复合物，旨在是见到与特异持续性相关的持续性状和尽可能克服恩杂鲁胺特异持续性的潜在口服复合 [ 68 ]。他们见到，诱导 BRAF 或南岸 MAPK 成分 MEK 和 ERK，强既有了 BRAF 持续性状触发激复合物结构域持续性状的 PCa 肝细胞对恩杂鲁胺的适合于持续性。这些见到暗示在 BRAF 持续性状的 PCa 中都共同诱导 MAPK 和 AR 自营的治疗法潜力。

雷等人。开展了激复合物第一组体量的 CRISPR/Cas9 检验，并考虑到肝线粒体复合物发挥作用激复合物 12 (CDK12) 对 PCa 肝细胞创造力至关举足轻重 [ 69 ]。CDK12胺THZ531兼具值得注意的抗骨髓起着。从机制上谈论，THZ531 下调 AR 接收机并优先诱导 CDK12 诱导适合于转录本 (CDK12-ISTs)。此外，他们见到 THZ531 与多种 AR 拮抗剂概要出值得注意的来进行起着。 借助于临床学术研究化学合成发病率小分子 DDR 自营的口服现在在几种同型式的帕金森氏症中都表现出治疗法其所 [ 77 , 78 ]。乔尔马尼还概要出对 DDR 弱点高血压高血压 PCa 的其所，将潜在的反应动物圣万扩展到 BRCA [ 9 , 10 ]。其他旨在诱导 DDR 的分子会和口服复合，如 ATR、ATM、CHK1 和 DNA-PK，也赢取了良好的学术研究 [ 79 , 80 , 81 , 82 , 83 ]。齐默尔曼等人。在广泛的三种并不相同肝细胞系（Hela、RPE-hTERT 和 SUM149PT）中都可用 PARP 胺乔尔马尼治疗法开展了 CRISPR-KO 检验，并呈现了一第一组很高可信度的 73 个持续性状，这些持续性状在暴发持续性状时不会加剧对 PARP 胺的适合于持续性降较低 [ 70 ]。就此，他们见到核糖核酸复合物 H2 (RNASEH2) 的弱点使肝细胞对 PARP 诱导适合于，从而颇受阻缺乏核糖核酸复合物 H2 的肝细胞中都的核糖核苷酸切除修复，加剧 PARP 捕获挫伤，侵害 DNA 复制并侵害持续性状第一组正确持续性。除此以外的是，RNASEH2 还通过另一个 CRISPR-KO 检验考虑到了加剧 ATR 胺化学合成窒息持续性的弱点 [ 71 ]。

在几种同型式的癌肝细胞系（293A、HCT116 和 MCF10A）中都可用 ATR 胺开展的仅有持续性状第一组 KO 检验暗示，RNASEH2 缺乏在肾脏和细胞内均不会诱导 ATR 胺适合于持续性。尽管这两项学术研究都在非 PCa 癌肝细胞系中都开展了 CRISPR 检验，但他们解析了 RNASEHEB 的丢弃，这在 PCa 字段中都特别罕见（很高达 20% 或更多），通过 PARP 或 ATR 诱导加剧化学合成发病率，暗示RNASEH2B 长时间是两种口服治疗法 PCa 高血压的潜在关键因素。 二甲双抗流感病毒是一种口服双抗流感病毒类口服，作为 2 同型肾病的一线治疗法口服，因其对最主要 PCa 在内的多种实体瘤的抗增殖和抗癌起着而备颇受关注[ 84 , 85 ]。然而，关于二甲双抗流感病毒的可用与暴发 PCa 的风险和生存率相互间的关联持续性，现在刊文了相互间矛盾的结果 [ 86 ]。现阶段，正在学术研究二甲双抗流感病毒共同小分子睾酮复合物轴的口服对 CRPC 高血压和 RP 后接颇受补救持续性放疗的高血压的额外起着。总体而言，二甲双抗流感病毒借助于与 PCa 相互间的关系仍长期存在异议。陈等人。通过可用 SAM 库里开展仅有持续性状第一组 CRISPR/Cas9 触发检验，为推定 DU145 肝细胞中都二甲双抗流感病毒致病的遗传学关键因素共享了重新证词 [ 72 ]。结果暗示，ECE1、ABCA12、BPY2、EEF1A1、RAD9A 和 NIPSNAP1 有利于 PCa 肝细胞对二甲双抗流感病毒的特异持续性。他们促使解析，RAD9A 确实通过降至恒定持续性 T 肝细胞参与二甲双抗流感病毒的骨髓免疫微环境 (TIME) 恒定。 染剂既有其会扯亚胺复合物 (ADI) ADI-PEG20 已在最主要 PCa 在内的至少 20 项 I/II 期临床学术研究试验中都开展了学术研究，并已解析兼具出色的安仅有持续性 [ 87 , 88 , 89 ]。都只的试验暗示，与其他口服共同可用可治疗法多种帕金森氏症 [ 90 , 91 , 92 ]。

为了考虑到给与治疗法发挥作用的新因素，Chu 等人。在用 ADI 处理方式的 ADI 发挥作用 M231 肝细胞中都开展了仅有持续性状第一组 CRISPR-KO 检验，并通过触发 AKT/mTOR/STAT3/CCL2 都能，紧密结合 RNA-seq 比对考虑到 TREM-CCL2 都能是发挥作用的无疑[ 73 ]。他们还在 PC3 PCa 肝细胞基本概念中都促使解析了结果。本学术研究概要了 ADI 致病的新都能，并为克服结核病和 PCa 中都的 ADI 致病共享了重新靶点。

4.结论

持续性状第一组DNA的最新十分困难为 CRPC 的分子会学术研究共享了重新立论。DNA 修复弱点的检查，同上如 BRCA2 的持续性状，可以他的学生唯项接颇受铂既有疗 ] 或聚（ADP-核糖）聚合复合物 (PARP) 胺 [ 9 ] 治疗法的高血压，而据刊文，错配修复持续性状和微卫星不稳定持续性是核查点胺免疫治疗法适合于持续性的恒定剂 。病因不好的特征，同上如长期存在 RB1 弱点 ，确实不会他的学生没来的治疗法战略。 仅有持续性状第一组 CRISPR/Cas9 检验为转告此类持续性状共享了一种平稳且理应的作法，自 2014 年发售以来，一系列兼具历史持续性意义的研究报告暗示，该高效率造成了了很高质量的系统齐射都 [ 12 ]。该高效率与其他正交作法（同上如质谱仪）相紧密结合，在系统体量上学术研究复合物质系统，可以共享有价值的系统立论，而可用传统作法无需数年时间才能建立上去。

这篇流行病学再次展示了迄今关于 PCa 的几个检验结果。由于该科技领域有一些特定的失常，最主要肝细胞系数量有限，因此必须仔细洞察与临床学术研究相关持续性的乙同型肝炎结果以可知临床学术研究环境。即使考虑到这一点，这里参阅的学术研究也有确实兼具临床学术研究举足轻重持续性。除此以外的是，其他癌肝细胞系中都的一些 CRISPR 检验也为 PCa 共享了重新遗传物质 [ 63 , 70 , 71 ]，这暗示在任何同型式的癌肝细胞中都天气预报乙同型肝炎结果的举足轻重持续性，这确实不会加剧见到用做 CRPC 治疗法的动物圣万。在这方面，DepMap 等图表门户共享了帮助，因为现在在最主要 PCa 在内的数百个肝细胞系中都以多帕金森氏症由此可知方式制定了 CRISPR 检验。如上所述，他们对其他骨髓的图表比对确实对 PCa 精确，也就是说。

关于本文参阅的检验中都的新要能，有应该在不久的将来对 PCa 高血压开展促使学术研究。 我们通过持续性状第一组学术研究（同上如 CRISPR 检验）对 CRPC 分子会特征的洞察将以降较低分子会测试的基本上引入临床学术研究，以降较低口服可用和临床学术研究试验教师资格。因此，CRPC 高血压将越发多地颇受益于我们对持续性状第一组转变在 PCa 病因学中都的起着以及治疗法兼具特定持续性状的高血压的潜力的理解。

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